Un marcador biológico (biomarcador) es definido como “una característica definida que se mide como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas a una exposición o intervención”, incluidas las intervenciones terapéuticas Califf RM. Biomarker definitions and their applications. Exp Biol Med (Maywood). 2018 Feb 1;243(3):213-21. [Pubmed][1] FDA-NIH Biomarker Working Group. BEST (Biomarkers, EndpointS, and other Tools) Resource. Silver Spring (MD): Food and Drug Administration (US); 2016. [Pubmed][2] . Los biomarcadores se pueden encontrar en la sangre, otros fluidos corporales, órganos y tejidos, y proporcionan una indicación del estado biológico de un organismo.

En función de su naturaleza, se distinguen biomarcadores fisiológicos (por ejemplo, la presión arterial y la temperatura corporal), biomarcadores de imagen (por ejemplo, la resonancia magnética con contraste para detectar tumores, los rayos X para detectar fracturas óseas, la angiografía) y biomarcadores moleculares (por ejemplo, el nivel de colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad –LDL–, el recuento de glóbulos rojos, las enzimas hepáticas y el antígeno prostático específico –PSA–) (Figura 1) U. S. Food and Drugs Administration (FDA). About Biomarkers and Qualification. FDA; 2021. Disponible en: [Enlace][3] .

Los biomarcadores también se pueden clasificar por lo que miden y por sus posibles aplicaciones. Por ejemplo, un biomarcador puede confirmar un diagnóstico, dar informaciones sobre la probabilidad de desarrollar una enfermedad, su progresión y la respuesta a un tratamiento; también se distinguen biomarcadores de pronóstico y predictivos (Figura 1) Califf RM. Biomarker definitions and their applications. Exp Biol Med (Maywood). 2018 Feb 1;243(3):213-21. [Pubmed][1] FDA-NIH Biomarker Working Group. BEST (Biomarkers, EndpointS, and other Tools) Resource. Silver Spring (MD): Food and Drug Administration (US); 2016. [Pubmed][2] .

Los biomarcadores de naturaleza proteica representan una herramienta muy útil en la investigación, como también en la clínica y en el desarrollo de fármacos más efectivos. Los niveles endógenos de un biomarcador pueden dar información sobre el estadio de una enfermedad o su respuesta a un tratamiento, así como también sobre la susceptibilidad de sujetos sanos al desarrollo de determinadas condiciones patológicas. Sin embargo, la concentración de un biomarcador puede variar notablemente entre las fases presintomática, del comienzo de la enfermedad, sintomática o avanzada (Figura 2A). Además, independientemente del estadio de la enfermedad, los niveles de biomarcadores bajan notablemente en muestras más alejadas del foco de la enfermedad, aunque tienen la ventaja de poderse obtener con más facilidad y de forma menos invasiva (por ejemplo, muestra de sangre vs. biopsia de tejido) (Figura 2A). Eso implica que biomarcadores proteicos relevantes desde un punto de vista médico pueden encontrarse en concentraciones extremadamente bajas, por ejemplo, en sujetos sanos o en fases precoces de una patología, o en muestras biológicas poco invasivas. Por lo tanto, para su detección, hace falta disponer de técnicas con una sensibilidad muy elevada.

Los inmunoensayos, basados en la interacción antígeno-anticuerpo, siguen siendo la tecnología más específica para detectar biomarcadores de naturaleza proteica. Sin embargo, los inmunoensayos convencionales como el ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima), la quimioluminiscencia o la electroquimioluminiscencia (ECL) limitan los niveles de detección al orden del nano- o picomolar, no permitiendo la medición de una gran cantidad de proteínas secretadas que se encuentran por debajo de este umbral. Al contrario, un inmunoensayo de nueva generación, la tecnología SIMOA (single molecule array), recientemente desarrollada por la empresa Quanterix (Billerica, MA, USA), ha permitido alcanzar niveles de detección ultrasensible de femtomolar, abriendo nuevos escenarios en el estudio de los biomarcadores de naturaleza proteica.

El campo de las enfermedades neurodegenerativas, en particular, se está beneficiando del desarrollo de esta tecnología. Los biomarcadores que se originan en el sistema nervioso central (SNC) y que reflejan los procesos patológicos responsables de las enfermedades neurodegenerativas se pueden encontrar en concentración elevada en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en concentración mucho más baja en la sangre (Figura 2B). Disponer de técnicas de detección ultrasensible como el SIMOA permite trasladar el estudio de biomarcadores de neurodegeneración desde las muestras de LCR a muestras de sangre, más fácil de obtener.

A continuación, se va a describir cómo la tecnología SIMOA alcanza esta ultrasensibilidad, en comparación con otros inmunoensayos convencionales.

1.1. Inmunoensayos convencionales y limitaciones

El ELISA o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima es el método clásico comúnmente usado para la detección de proteínas y se basa en la interacción antígeno-anticuerpo. Brevemente, un anticuerpo de captura que se inmoviliza en un sustrato sólido se une a una proteína de interés presente en las muestras analizadas. Varios tipos de muestras pueden ser analizadas, incluidos plasma, suero, células y tejidos, medios acondicionados u orina.

Existen diferentes formatos de ELISA, de los cuales el más común es el ELISA de tipo sándwich, que utiliza 2 anticuerpos, uno de captura, inmovilizado en una superficie (por ejemplo, la superficie plástica de un pocillo de placa de 96 pocillos), y uno de detección marcado, para detectar una proteína target (Figura 3A). El anticuerpo de detección es marcado con una enzima (peroxidasa de rábano picante –HRP–) a través de la unión biotina-avidina. La enzima HRP produce, en presencia de un sustrato, una señal medible, colorimétrica o fluorescente. En el caso de la señal colorimétrica, la HRP reduce un sustrato cromogénico, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), a su forma azul y oxidada. El cambio de color es proporcional a la cantidad de HRP y, por lo tanto, a la cantidad de proteína diana en la muestra. La reacción colorimétrica se detiene añadiendo ácido sulfúrico y el color cambia de azul a amarillo. La absorbancia se mide a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Este formato de tipo sándwich es muy específico y la concentración del analito se puede determinar con una curva estándar, mediante la utilización de concentraciones conocidas de antígeno. La sensibilidad de un ELISA estándar depende de la sensibilidad de los anticuerpos utilizados y generalmente se queda en el rango de pg/mL.

Si la enzima acoplada al anticuerpo de detección cataliza una reacción quimioluminiscente, con emisión de fotones y producción de luz, se habla de CLIA (chemiluminescent immunoassay). Generalmente, los ensayos CLIA tienen una sensibilidad más alta que los ELISA estándar. Una variante aún más sensible es el ECL (electrochemiluminescent), donde el anticuerpo de detección está conjugado, en vez de con una enzima, con una molécula que produce directamente luz durante una reacción electroquímica. El uso de una señal eléctrica en lugar de óptica (como en el ELISA) confiere a la ECL una mayor sensibilidad, aunque no baja del rango de pg/mL Kuhle J, Barro C, Andreasson U, Derfuss T, Lindberg R, Sandelius Å, et al. Comparison of three analytical platforms for quantification of the neurofilament light chain in blood samples: ELISA, electrochemiluminescence immunoassay and Simoa. Clin Chem Lab Med. 2016 Oct 1;54(10):1655-61. [Pubmed][4] .

Como se ha especificado previamente, la señal producida enzimáticamente o electroquímicamente es directamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra, sin llegar a medir niveles de molécula única y devolviendo una señal de tipo analógico. La sensibilidad analítica resulta limitada por la misma técnica, porque la señal, independientemente de su naturaleza, difunde y se diluye en un volumen grande (generalmente 100 µL), y hacen falta millones de moléculas para superar el fondo y llegar al límite de detección.

Además de ser un inmunoensayo analógico, el ELISA y sus variantes no se han integrado en un sistema automatizado que pueda reducir la variabilidad y aumentar la eficiencia, reduciendo el tiempo de trabajo. Al contrario, el flujo de trabajo para un inmunoensayo convencional implica varias intervenciones por parte del usuario, como en la preparación de las muestras, en las incubaciones con los anticuerpos o los lavados.

Figura 1. Clasificación de los biomarcadores. Los biomarcadores dan informaciones sobre el estado biológico de un organismo y se pueden clasificar en función de su naturaleza y sus posibles aplicaciones y objetivos en la clínica.

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Figura 2. Relevancia de los biomarcadores. A: una de las dianas de la medicina preventiva es poder detectar biomarcadores de enfermedad de forma temprana y en fluidos biológicos de fácil accesibilidad y no invasivos; para eso, hay que disponer de técnicas avanzadas de detección (adaptada de Quanterix); B: los biomarcadores de enfermedades neurológicas se pueden encontrar en concentraciones elevadas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y de allí pueden pasar a la sangre, donde mantienen niveles de concentración mucho más bajos. Inmunoensayos ultrasensibles pueden detectar estas moléculas indicadoras de neurodegeneración no solo en el LCR sino también en la sangre.

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Figura 3. Resumen gráfico de la técnica SIMOA. A: ELISA de tipo sándwich clásico; B: formación del inmunocomplejo y su compartimentalización con la técnica SIMOA; C: resumen del flujo de trabajo de un ensayo SIMOA; el inserto muestra un disco SIMOA, con los 24 arrays; 1: anticuerpo de detección; 2: enzima conjugada con estreptoavidina.