1.2. Tecnología SIMOA: principios y procedimiento

Recientemente, se ha introducido un método digital de ELISA basado en matrices (arrays) de una sola molécula (single molecule array –SIMOA–) Rissin DM, Kan CW, Campbell TG, Howes SC, Fournier DR, Song L, et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol. 2010 Jun 23;28(6):595-9. [Pubmed][5]        , que permite la detección de hasta una única molécula proteica en inmunocomplejos marcados con una única enzima. Esta técnica ha permitido aumentar considerablemente la sensibilidad del inmunoensayo hasta concentraciones de subfemtomolar, resultando en una sensibilidad analítica 100-1.000 veces mayor que un ELISA convencional y permitiendo la detección de biomarcadores de interés sea a niveles normales, en sujetos sanos o presintomáticos, o a niveles agudos, en diferentes tipos de muestras, especialmente en sangre.

Un ensayo SIMOA sigue siendo, en efecto, un ensayo ELISA sándwich clásico, ya que se basa en la formación de inmunocomplejos entre anticuerpo de captura (capture antibody), antígeno, anticuerpo de detección (detection antibody) conjugado con biotina y estreptoavidina marcada con enzima (β-galactosidasa) (Figura 3B).

Un ensayo SIMOA se puede dividir en 2 partes principales: una primera fase de captura y marcado del analito target (un ELISA estándar), seguida del aislamiento de cada inmunocomplejo para la cuantificación del analito (digitalización); y una segunda parte de conteo de moléculas y procesamiento de los datos digitales.

En la primera fase del ensayo, el anticuerpo de captura y el de detección reconocen el analito target presente en la muestra biológica uniéndose a epítopos diferentes, mientras que la estreptoavidina, debido a su elevada afinidad por la biotina, une a esta última la enzima β-galactosidasa responsable de catalizar la reacción que produce la señal, en este caso fluorescente, en presencia de un sustrato fluorogénico (resorufina β-D-galactopiranósido). A diferencia de un ELISA clásico, en un ensayo SIMOA el anticuerpo de captura está conyugado a microesferas (beads) magnéticas microscópicas (2,7 µm de diámetro) en vez de estar pegado en el fondo de los pocillos de una placa (Figura 3B). Los inmunocomplejos así formados, constituidos por bead-anticuerpo de captura-analito target-anticuerpo de detección marcado con enzima vienen, por tanto, aislados, en presencia del sustrato fluorogénico, en micropocillos cuya dimensión del orden de femtolitros permite a una sola bead alojarse (Figuras 3B y 3C). Los micropocillos están organizados en discos SIMOA de 24 arrays y cada array contiene unos 216.000 micropocillos (Figura 3C). Cada array de micropocillos es utilizado por una sola muestra; eso significa que cada disco SIMOA vale para el análisis simultáneo de 24 muestras.

Después de que los inmunocomplejos se han cargado en los arrays, cada uno en su micropocillo en presencia del sustrato, sigue un proceso de sellado con aceite para eliminar factores confundentes como polvo, detritos, exceso de beads y para limitar al máximo la difusión del producto fluorescente. En cada micropocillo va a ocurrir la reacción de detección catalizada por la enzima estreptoavidina-β-galactosidasa, conjugado por medio de la unión biotina-estreptoavidina al anticuerpo de detección. Se genera así un producto fluorescente (resorufina) en un volumen muy pequeño (50 fL) (Figura 3C). Sigue un proceso de imaging y cuantificación del analito (véase más adelante).

La compartimentalización de la reacción, junto a la escasa difusión de la fluorescencia debido al sellado de cada pocillo con aceite, permite la detección de hasta una sola molécula de biomarcador de interés, ya que localmente la concentración de producto fluorescente asociado hasta a un solo inmunocomplejo resulta muy elevada y por lo tanto medible. En un inmunoensayo convencional, al contrario, la reacción enzima-sustrato se produce en un volumen mucho mayor, entre 50 y 100 µL, diluyendo la señal del producto fluorescente. La difusión y la dilución de la señal limita, por lo tanto, la sensibilidad de los inmunoensayos convencionales en el rango de picomolar, como se ha explicado en el párrafo anterior.

La imagen de cada array es adquirida por un sistema de imagen que incluye un microscopio y una cámara: el sistema permite la adquisición de imágenes en campo claro y de fluorescencia (574 nm excitación-620 nm emisión) de cada array. La imagen en campo claro se usa para detectar la presencia de beads. La imagen de fluorescencia indica la actividad enzimática en cada micropocillo e, indirectamente, la presencia del analito target.

La señal fluorescente viene captada por una cámara que abarca el array completo: cada micropocillo con señal (activo) o sin señal (inactivo) se cuenta como ON u OFF, respectivamente, y constituye una señal digital correspondiente a la presencia o ausencia de al menos una molécula de enzima. El “digital” atribuido a la técnica deriva de esta forma de análisis, posible gracias a la compartimentalización de cada inmunocomplejo. A través del análisis computarizado de las imágenes adquiridas, se determina la fracción de beads asociada con enzimas (fraction ON –fON–) y la intensidad de la fluorescencia por cada pocillo, y se calcula el promedio de enzimas por cada bead (average enzyme per bead –AEB–), que representa la unidad fundamental para el cálculo de la concentración de analito target con la técnica SIMOA. Usando una curva de calibrado con concentraciones conocidas del analito target, desde los AEB se calcula la concentración de analito en cada muestra.

Una ulterior ventaja de la tecnología SIMOA es su doble enfoque, digital y analógico, dependiendo de la concentración de analito target en la muestra analizada (Figura 4A). A bajas concentraciones de analito, cada bead estará estadísticamente asociada con una sola enzima o ninguna, y, para calcular los AEB, las imágenes serán analizadas de forma digital, contando los micropocillos activos/ON. A concentraciones más altas, cuando cada bead tiene asociado por lo menos una enzima o más, los AEB se calculan de forma analógica, mediante la medición de la intensidad de fluorescencia media de las beads activas y conociendo la intensidad de fluorescencia media generada por una sola enzima.

Este doble enfoque combina la ultrasensibilidad de la técnica con un amplio rango analítico y permite la detección de biomarcadores en un amplio rango de concentraciones, clínicamente relevante Rissin DM, Fournier DR, Piech T, Kan CW, Campbell TG, Song L, et al. Simultaneous Detection of Single Molecules and Singulated Ensembles of Molecules Enables Immunoassays with Broad Dynamic Range. Anal Chem. 2011 Mar 15;83(6):2279-85. [Pubmed][6]        .

Cabe destacar que se han desarrollado ensayos SIMOA multiplexing, que permiten medir en la misma muestra hasta 6 diferentes analitos a la vez, con el consecuente ahorro de volumen de muestra y tiempo de análisis, sin comprometer la sensibilidad del ensayo. La posibilidad de detectar diferentes biomarcadores a la vez se obtiene utilizando una combinación de beads codificadas con diferentes propiedades de fluorescencia e intensidad para cada analito de interés (Figura 4B). En la fase de imaging, las diferentes subpoblaciones de beads vienen identificadas por sus propiedades intrínsecas. Una vez identificada cada subpoblación, la señal de la resorufina debida a cada inmunocomplejo sigue igual, exactamente como para los ensayos para un solo biomarcador (singleplex), y se utiliza para la cuantificación de cada analito (como se ha descrito arriba).

La tecnología SIMOA ha sido desarrollada y comercializada por la empresa estadunidense Quanterix, en 2 tipologías de plataformas, como se describe a continuación. Actualmente, su relevancia científico-clínica y traslacional se refleja en su amplia utilización para aplicaciones de investigación en varias áreas terapéuticas, que incluyen oncología, neurología, cardiología, inflamación y enfermedades infecciosas.

1.2.1. Plataformas disponibles

La tecnología SIMOA basada en microesferas está disponible en 2 formatos: integrada en un instrumento completamente automatizado, el HD-X, o en un instrumento semiautomático de dimensiones menores y de sobremesa, el SR-X. El principio básico, la separación de cada inmunocomplejo en un único pocillo de un volumen de femtolitros, es el mismo en ambas plataformas, como también es el mismo el flujo de trabajo. Por lo tanto, las diferencias entre las 2 plataformas están principalmente en la cantidad de trabajo manual que hace falta para obtener los resultados y en las dimensiones.

1.2.2. HD-X

El primer analizador SIMOA disponible en el mercado, comercializado por la empresa Quanterix, fue el analizador HD-1 (7). El analizador HD-X (Figura 5A) es el modelo más avanzado y mantiene el mismo flujo de trabajo del modelo anterior, mejorando la productividad y la flexibilidad para el usuario, e incorporando un sistema de control interno de temperatura.

El analizador HD-X constituye una plataforma completamente automatizada de inmunoensayos basados en microesferas SIMOA, que une la ultrasensibilidad en la detección de proteínas con la completa automatización: el equipo se encarga de realizar todos los pasos del ensayo, reduciendo al mínimo la intervención por parte del usuario, con la consecuente minimización de la variabilidad y el aumento de reproducibilidad y el rendimiento. Una vez que los reactivos se cargan en el instrumento, se tarda aproximadamente 3 horas en obtener los datos. El equipo también permite el análisis simultáneo de hasta 6 biomarcadores a la vez.

Un analizador SIMOA HD-X se compone de 5 módulos principales Wilson DH, Rissin DM, Kan CW, Fournier DR, Piech T, Campbell TG, et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J Lab Autom. 2016 Aug 1;21(4):533-47. [Pubmed][7]        :

1. Módulo de entrada para reactivos, fungible (pipetas, cubetas, discos), y muestras.
2. Módulo para buffers y desechos.
3. Interfaz de control para el usuario, con pantalla táctil y ordenador integrados, para el control del instrumento, de los ensayos y de los resultados.
4. Módulo de química, que es un robot de procesamiento secuencial para el ensayo ELISA basado en microesferas descrito en el parágrafo anterior (Figura 3C): 2 pipeteadores robóticos se encargan de todas las operaciones de incubación de la muestra con microesferas, anticuerpos y enzimas, y de los lavados.
5. Módulo SIMOA load-seal-image (LSI), donde se cargan los discos SIMOA con los inmunocomplejos y el sustrato, y se sacan las imágenes de cada array a través de un sistema óptico basado en fluorescencia, que incluye un módulo de iluminación y un microscopio con lentes objetivo y rueda de filtro. Las imágenes, capturadas por una cámara, vienen analizadas a través de un software y la señal fluorescente se transforma en concentración por medio de una curva de calibrado.

1.2.3. SR-X

El equipo SR-X (Figura 5B) es un instrumento más compacto, de sobremesa, que une las capacidades de detección de proteínas a nivel ultrasensible con la versatilidad de dimensiones y de flujo de trabajo. La preparación de la muestra, como también los pasos de incubación con los reactivos y las fases de lavados son manuales, mientras que el equipo se encarga de cargar las muestras en los arrays, de la detección de la señal en los discos SIMOA y de devolver los resultados de concentración. Como en el caso del equipo HD-X, el SR-X permite la detección en multiplex de hasta 6 biomarcadores a la vez usando un volumen bajo de muestra.