3. Biomarcadores moleculares en la enfermedad de Parkinson

3.1. Técnicas utilizadas para la detección de alfa-sinucleína

3.1.1. Inmunoensayo

3.1.1.1. Enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA)

ELISA es una técnica que se basa en anticuerpos para determinar y cuantificar la presencia de un ligando específico (habitualmente una proteína). Existen muchas variantes de esta técnica (ELISA directo, indirecto, de tipo sándwich…) y diferentes metodologías, pero todas tienen en común la fijación de un ligando y su detección mediante un anticuerpo (ELISA directo) o dos, uno primario y otro secundario (ELISA indirecto y sándwich).

Cuando se pretende detectar alfa-sinucleína en muestras biológicas mediante ELISA, hay que tener en cuenta los siguientes factores:

• Qué tipo de alfa-sinucleína se quiere detectar: monomérica, oligomérica/agregada o ambas (total). La mayor parte de las técnicas disponibles están pensadas para detectar la alfa-sinucleína total, pero también se han diseñado kits para la detección específica de oligómeros o agregados.
• Qué isoforma de alfa-sinucleína se quiere detectar: la mayoría de los anticuerpos reconocen el epítopo C-terminal codificado por el exón 5 del ARNm tras splicing alternativo. Por tanto, las isoformas 140 y 126 constituyen las dianas principales.
• Qué variante de alfa-sinucleína se quiere detectar: alfa-sinucleína no fosforilada o fosforilada. La forma fosforilada solo se encuentra presente en el suero, no se detecta en el líquido cefalorraquídeo (LCR) Cariulo C, Martufi P, Verani M, Azzollini L, Bruni G, Weiss A, et al. Phospho-S129 Alpha-Synuclein Is Present in Human Plasma but Not in Cerebrospinal Fluid as Determined by an Ultrasensitive Immunoassay. Front Neurosci. 2019 Aug 22;13:889. [Pubmed][20]      .
• Qué combinación de anticuerpos se quiere utilizar: se necesita un anticuerpo de captura y otro de detección. Hay muchos tipos y casas comerciales, por lo que a menudo difieren entre investigadores y experimentos.

Para detectar y cuantificar formas monoméricas de alfa-sinucleína se utiliza el ELISA indirecto (porque solo hay un epítopo para la unión del anticuerpo) y para detectar formas oligoméricas, el de tipo sándwich (hay más epítopos que permiten la unión de 2 anticuerpos) (Figura 2). Los pasos básicos de un ELISA son el coating (fijación de un antígeno a los pocillos de un microplate), el blocking (tamponamiento de las zonas de pocillos libres de antígeno), los lavados y la detección.

En el ELISA de tipo sándwich para la detección de alfa-sinucleína oligomérica el coating se hace con un anticuerpo primario comercial anti-sinucleína que se denominará “anticuerpo de captura”. Los complejos proteicos como el anticuerpo se quedan anclados a cada pocillo del microplate. Se realiza un lavado para eliminar el resto de los componentes no anclados y a continuación se realiza el blocking, que consiste en bloquear las zonas del pocillo que no tienen antígenos anclados mediante un agente químico, para reducir las posibilidades de unión de un anticuerpo a sustratos no específicos (reacciones cruzadas). A continuación, se añade la muestra líquida a estudio (por ejemplo, suero, LCR, piel lisada… que pueda contener el antígeno de interés como la alfa-sinucleína) y que se unirá, si está presente, al anticuerpo de captura anclado al fondo del pocillo, formando un complejo. Se lavarán los pocillos y aquellos antígenos no unidos al anticuerpo de captura serán eliminados.

Después se utilizará un anticuerpo secundario llamado “anticuerpo de detección”, porque lleva ligada una enzima, que se unirá a los antígenos presentes (todos los antígenos presentes estarán unidos al anticuerpo de captura porque si no se habrían desprendido en el lavado previo). De esta manera, el antígeno queda entre dos anticuerpos, uno de captura anclado al pocillo y uno de detección (sándwich). Se realiza un nuevo lavado para eliminar los anticuerpos de detección no unidos al complejo anticuerpo de captura-antígeno y finalmente se añade un sustrato para la enzima que lleva el anticuerpo de detección (los anticuerpos de detección libres no unidos se habrían desprendido en el lavado previo y con ellos la enzima, por lo que no reaccionarán). La reacción generará un color en los pocillos que contengan el antígeno, los positivos. El grado de positividad (de colorante, que representa la cantidad del antígeno) se puede después cuantificar con un espectrofotómetro.

El ELISA indirecto sería similar pero el coating se realiza con la muestra del paciente que contiene el antígeno y después se añaden el anticuerpo de detección y el de captura Alhajj M, Farhana A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay. StatPearls. 2022 Feb 2. Disponible en: [Enlace][21]      .

Mediante diferentes variaciones de esta técnica se ha intentado cuantificar la presencia de alfa-sinucleína en suero, LCR, piel lisada y otros fluidos biológicos. Si bien algunos resultados pueden ser prometedores, los primeros estudios se caracterizaban por su baja sensibilidad diagnóstica, con superposición de valores de pacientes y controles, hallazgos discrepantes y formatos de ensayos muy diferentes. Otra de las principales limitaciones es que, al carecer de un marcador 100% específico, la capacidad diagnóstica tendrá gran variabilidad según las poblaciones comparadas (EP vs. controles sanos, EP vs. parkinsonismos atípicos, EP vs. enfermedad de Alzheimer, etc.).

Rentabilidad de la técnica ELISA para diferentes muestras biológicas:

• ELISA en LCR: disminución de alfa-sinucleína total, con sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 70-72 y el 52-83%, respectivamente Mollenhauer B, Locascio JJ, Schulz-Schaeffer W, Sixel-Döring F, Trenkwalder C, Schlossmacher MG. α-Synuclein and tau concentrations in cerebrospinal fluid of patients presenting with parkinsonism: a cohort study. Lancet Neurol. 2011 Mar;10(3):230-40. Erratum in: Lancet Neurol. 2011 Apr;10(4):297. [Pubmed][22]      . No obstante, la detección específica de la forma oligomérica de alfa-sinucleína, junto a la alfa-sinucleína total estándar en forma de ratio, permite aumentar la sensibilidad hasta un 89,3% y la especificidad hasta un 90,6% para diferenciar pacientes con EP de controles Parnetti L, Chiasserini D, Bellomo G, Giannandrea D, De Carlo C, Qureshi MM, et al. Cerebrospinal fluid Tau/α-synuclein ratio in Parkinson's disease and degenerative dementias. Mov Disord. 2011 Jul;26(8):1428-35. [Pubmed][23]      .
• ELISA en plasma: aumento de alfa-sinucleína oligomérica, con sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 53 y el 85%, respectivamente El-Agnaf OM, Salem SA, Paleologou KE, Curran MD, Gibson MJ, Court JA, et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 2006 Mar;20(3):419-25. [Pubmed][24]      . No obstante, la detección de α-syn-pSer129 tendría una sensibilidad y una especificidad para distinguir entre EP vs. controles del 85,6 y el 95,8%, respectivamente Lin CH, Liu HC, Yang SY, Yang KC, Wu CC, Chiu MJ. Plasma pS129-α-Synuclein Is a Surrogate Biofluid Marker of Motor Severity and Progression in Parkinson's Disease. J Clin Med. 2019 Oct 3;8(10):1601. [Pubmed][25]      .
• ELISA en saliva: disminución de alfa-sinucleína total y aumento de oligómeros, con sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 69,77 y el 95,16%, respectivamente, utilizando la ratio de oligómeros/alfa-sinucleína total Vivacqua G, Suppa A, Mancinelli R, Belvisi D, Fabbrini A, Costanzo M, et al. Salivary alpha-synuclein in the diagnosis of Parkinson's disease and Progressive Supranuclear Palsy. Parkinsonism Relat Disord. 2019 Jun;63:143-8. [Pubmed][26]      .

En definitiva, las técnicas de ELISA para la detección de alfa-sinucleína han sido fundamentales y pioneras, pero tienen limitaciones importantes y gran variabilidad en cuanto a su capacidad diagnóstica. Por este motivo, la irrupción de nuevas técnicas de detección más precisas como los seed amplification assays han ido reemplazado al ELISA en los últimos años.

3.1.2. Inmunoblot

Inicialmente se pensaba que era imposible detectar alfa-sinucleína mediante inmunoblot o Western blot (WB) debido a su baja concentración en las muestras, pero más adelante se demostró que la fijación de las proteínas con paraformaldehído permitía su detección Sasaki A, Arawaka S, Sato H, Kato T. Sensitive western blotting for detection of endogenous Ser129-phosphorylated α-synuclein in intracellular and extracellular spaces. Sci Rep. 2015 Sep 18;5:14211. [Pubmed][27]      . Sirve para detectar tanto monómeros como oligómeros de alfa-sinucleína. En el WB, para separar las proteínas de la muestra líquida por tamaño, se realiza un lisado de células mediante detergente y, tras centrifugado y calentado, se obtiene un sobrante en el que se cuantificará la concentración total de proteína con ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Después se agrega a un gel de electroforesis y se transfiere a una membrana. Se añade paraformaldehído a la membrana y se bloquea. Para su visualización se añaden un anticuerpo primario y secundario, después las bandas se escanean con infrarrojo para su cuantificación.

Rentabilidad de la técnica WB para diferentes muestras biológicas:

• WB en saliva: aumento de oligómeros con sensibilidad y especificidad en EP vs. controles del 92 y del 86%, respectivamente Cao Z, Wu Y, Liu G, Jiang Y, Wang X, Wang Z, Feng T. α-Synuclein in salivary extracellular vesicles as a potential biomarker of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 2019 Mar 23;696:114-20. [Pubmed][28]      .
• WB en plasma: resultados inconsistentes por la gran variabilidad entre estudios. En algunos estudios se detecta disminución de oligómeros en pacientes con EP vs. controles mientras que en otros se detecta un incremento.

3.1.3. Luminex®

El método Luminex® permite cuantificar de manera simultánea varias proteínas en muestras líquidas, a través de microesferas (beads) magnéticas que se conjugan con reactivos específicos. Mediante la adición de anticuerpos de captura y de detección de alfa-sinucleína acoplados a las microesferas, permite detectar la proteína. La conjugación de los anticuerpos con diferentes microesferas permite el análisis de múltiples dianas en cada muestra y esto aumenta la sensibilidad y la eficiencia respecto a un ELISA y un WB en la detección de alfa-sinucleína total.

Rentabilidad de la técnica Luminex® para diferentes muestras biológicas:

• Luminex® en LCR: disminución de alfa-sinucleína total en EP respecto a controles, con sensibilidad y especificidad del 93 y el 39%, respectivamente, utilizando WB y Luminex® y cuantificando DJ-1 Hong Z, Shi M, Chung KA, Quinn JF, Peskind ER, Galasko D, et al. DJ-1 and alpha-synuclein in human cerebrospinal fluid as biomarkers of Parkinson's disease. Brain. 2010 Mar;133(Pt 3):713-26. [Pubmed][29]      .
• Luminex® en plasma: no se han encontrado diferencias significativas entre EP y controles.

3.1.4. Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en tejidos

Los métodos de inmunohistoquímica (IHQ) e inmunofluorescencia (IF) permiten la visualización directa de los depósitos tisulares de alfa-sinucleína; en el caso de la IF, mediante marcado fluorescente.

Para la piel, la muestra más ampliamente utilizada, se realizan secciones de muestras cutáneas de un grosor determinado con un microtomo. Las secciones se transfieren a pocillos de un microplate, en los que después se añadirán dos anticuerpos primarios: uno para marcar la fibra nerviosa y otro para marcar alfa-sinucleína fosforilada. A continuación, se añaden los dos anticuerpos secundarios. Mediante un microscopio de fluorescencia o confocal se revelan los resultados: el marcado concomitante para fibra nerviosa y para alfa-sinucleína fosforilada se interpretará como positivo (Figura 3).

La morfología de depósitos de alfa-sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axones dérmicos. También se puede detectar alfa-sinucleína total en vez de fosforilada, pero la especificidad de la forma fosforilada para sinucleinopatías ronda el 100%, ya que no está presente en el tejido cutáneo de sujetos sanos.

Rentabilidad de la IHQ para diferentes muestras biológicas:

• IHQ/IF en piel: sensibilidad y especificidad del 81 y el 86%, respectivamente. La alfa-sinucleína fosforilada tiene una sensibilidad del 70-90% y una especificidad cercana al 100% Vacchi E, Pinton S, Kaelin-Lang A, Melli G. Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay. J Vis Exp. 2019 Jun 25;(148). [Pubmed][30]       Kim JY, Illigens BM, McCormick MP, Wang N, Gibbons CH. Alpha-Synuclein in Skin Nerve Fibers as a Biomarker for Alpha-Synucleinopathies. J Clin Neurol. 2019 Apr;15(2):135-42. [Pubmed][31]       Donadio V, Wang Z, Incensi A, Rizzo G, Fileccia E, Vacchiano V, et al. In Vivo Diagnosis of Synucleinopathies: A Comparative Study of Skin Biopsy and RT-QuIC. Neurology. 2021 May 18;96(20):e2513-e2524. Erratum in: Neurology. 2022 Jul 5;99(1):40-42. [Pubmed][32]      .
• IHQ/IF en tejido gastrointestinal: en general tiene una sensibilidad elevada > 80%, pero la especificidad suele ser peor, en torno al 70%. La precisión diagnóstica depende de la capa de tejido estudiado; en general, la submucosa es la que contiene mayor depósito de alfa-sinucleína Beach TG, Corbillé AG, Letournel F, Kordower JH, Kremer T, Munoz DG, et al. Multicenter Assessment of Immunohistochemical Methods for Pathological Alpha-Synuclein in Sigmoid Colon of Autopsied Parkinson's Disease and Control Subjects. J Parkinsons Dis. 2016 Oct 19;6(4):761-70. [Pubmed][33]      .
• IHQ/IF en glándula submaxilar, labial y mucosa olfatoria: estudios pequeños con resultados muy variables Malek N, Swallow D, Grosset KA, Anichtchik O, Spillantini M, Grosset DG. Alpha-synuclein in peripheral tissues and body fluids as a biomarker for Parkinson's disease - a systematic review. Acta Neurol Scand. 2014 Aug;130(2):59-72. [Pubmed][34]      .