4. Biomarcadores moleculares en la fase prodrómica de la enfermedad de Parkinson

Se ha investigado la rentabilidad de algunos de estos biomarcadores en lo que se denominaría la fase prodrómica de la EP, cuando no hay síntomas motores o estos son mínimos. El marcador clínico no motor más utilizado en la selección de estos pacientes ha sido el trastorno de la conducta del sueño REM (TCSREM). Se ha visto que la determinación de alfa-sinucleína mal plegada mediante real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) tiene una sensibilidad y una especificidad del 90% para predecir el desarrollo de EP o demencia con cuerpos de Lewy en cohortes con seguimiento a 10 años Iranzo A, Fairfoul G, Ayudhaya ACN, Serradell M, Gelpi E, Vilaseca I, et al. Detection of α-synuclein in CSF by RT-QuIC in patients with isolated rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a longitudinal observational study. Lancet Neurol. 2021 Mar;20(3):203-12. [Pubmed][35]      . En los pacientes con TCSREM e hiposmia, la determinación de alfa-sinucleína mal plegada por RT-QuIC en la mucosa olfatoria predice con una sensibilidad del 73% el desarrollo de EP Stefani A, Iranzo A, Holzknecht E, Perra D, Bongianni M, Gaig C, et al.; SINBAR (Sleep Innsbruck Barcelona) group. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 2021 May 7;144(4):1118-26. [Pubmed][36]      . La cuantificación de alfa-sinucleína por inmunocaptura de exosomas neuronales consigue predecir con una sensibilidad del 95% y una especificidad del 93% la EP en pacientes con TCSREM Jiang C, Hopfner F, Katsikoudi A, Hein R, Catli C, Evetts S, et al. Serum neuronal exosomes predict and differentiate Parkinson's disease from atypical parkinsonism. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Jul;91(7):720-9. [Pubmed][37]      .

4.1. Inmunocaptura

La inmunocaptura de exosomas neuronales en suero es una técnica novedosa que consigue aislar exosomas neuronales para cuantificar la alfa-sinucleína contenida. Los exosomas son pequeñas vesículas que se unen a células participando en el tráfico de proteínas agregadas y otras sustancias. Los exosomas neuronales representan el microambiente cerebral en cada momento, por lo que su aislamiento en un fluido periférico es un biomarcador del estado del tráfico de proteínas en ese momento particular.

La inmunocaptura de exosomas mediante anticuerpos anti-L1CAM y su posterior determinación con espectrometría en la fracción de densidad adecuada permite aislarlos de sangre periférica. Después se realiza un marcado de pSer129, clusterina y anti-sintenina 1 mediante anticuerpos de captura. La clusterina está elevada en procesos neurodegenerativos de tipo no-sinucleinopatías y la anti-sintenina 1 es un marcador control de la presencia de exosomas. Finalmente, se añaden los anticuerpos secundarios de detección y se revelan los resultados por electroquimioluminiscencia. La sensibilidad y la especificidad de este método para diferenciar EP vs. controles sanos es del 94 y el 96%, respectivamente Jiang C, Hopfner F, Katsikoudi A, Hein R, Catli C, Evetts S, et al. Serum neuronal exosomes predict and differentiate Parkinson's disease from atypical parkinsonism. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Jul;91(7):720-9. [Pubmed][37]      .

4.2. Alpha-synuclein seed amplification assays (SAA)

4.2.1. Protein misfolding cyclic amplification (PMCA)

La técnica PMCA es análoga a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya que se basa en la reacción cíclica a expensas de un sustrato, aunque con proteínas en vez de con nucleótidos, permitiendo la replicación de proteínas mal plegadas. También es muy similar a la RT-QuIC, pero se basa en la sonicación para promover la amplificación, mientras que RT-QuIC se basa en el shaking. La técnica consiste en ciclos de incubación y sonicación que incrementan de forma exponencial las seeds de alfa-sinucleína para su posterior agregación hasta niveles detectables por técnicas bioquímicas.

Se utilizan plásmidos portadores del gen de alfa-sinucleína humana para expresar la proteína en células. La proteína obtenida se purifica y se filtra. Se confirma que se han formado oligómeros mediante fluorescencia con tioflavina (ThT) u otros métodos alternativos. Para preparar las seeds de alfa-sinucleína a partir de la muestra del paciente (habitualmente LCR), se realiza incubación y sonicación para romper los agregados de alfa-sinucleína e incrementar los núcleos de crecimiento, que mediante shaking se volverán a agregar de manera creciente. Se añaden a cada pocillo de un microplate, que contiene los oligómeros de alfa-sinucleína, y se realiza una agitación cíclica, monitorizando la fluorescencia de ThT con espectrofluorómetro, para evaluar los diferentes parámetros cinéticos de agregación (tiempo hasta fluorescencia, tiempo hasta el 50% de fluorescencia máxima…) Shahnawaz M, Tokuda T, Waragai M, Mendez N, Ishii R, Trenkwalder C, et al. Development of a Biochemical Diagnosis of Parkinson Disease by Detection of α-Synuclein Misfolded Aggregates in Cerebrospinal Fluid. JAMA Neurol. 2017 Feb 1;74(2):163-72. [Pubmed][38]      .

Rentabilidad de la técnica PMCA para diferentes muestras biológicas:

• PMCA en LCR: la sensibilidad y la especificidad para diferenciar la EP de controles y otras enfermedades neurodegenerativas es del 88,5 y el 94%, respectivamente Shahnawaz M, Tokuda T, Waragai M, Mendez N, Ishii R, Trenkwalder C, et al. Development of a Biochemical Diagnosis of Parkinson Disease by Detection of α-Synuclein Misfolded Aggregates in Cerebrospinal Fluid. JAMA Neurol. 2017 Feb 1;74(2):163-72. [Pubmed][38]      .
• PMCA en piel: la sensibilidad y la especificidad para diferenciar la EP de controles es del 80-83 y el 90-100%, respectivamente Wang Z, Becker K, Donadio V, Siedlak S, Yuan J, Rezaee M, et al. Skin α-Synuclein Aggregation Seeding Activity as a Novel Biomarker for Parkinson Disease. JAMA Neurol. 2020 Sep 28;78(1):1-11. Erratum in: JAMA Neurol. 2021 Jan 1;78(1):120. [Pubmed][39]      .

4.2.2. Real-time quaking-induced conversion

La técnica RT-QuIC, al igual que la PMCA, se basa en la amplificación y agregación de seeds de alfa-sinucleína sobre un sustrato de la proteína recombinante. A diferencia de la PMCA, no utiliza sonicación sino shaking, es metodológicamente mucho más simple y tiene una sensibilidad ligeramente más elevada.

Se prepara una reacción tamponante con alfa-sinucleína recombinante y ThT, que se transfiere a pocillos donde posteriormente se agrega la muestra (LCR, homogeneizados de tejido…) previamente centrifugada para remover componentes celulares. Se somete la mezcla a ciclos de shaking y posteriormente se mide la fluorescencia de ThT (Figura 4). Recientemente se han incorporado técnicas ultrasensibles que permiten mejorar aún más la rentabilidad diagnóstica.

• RT-QuIC en LCR: sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 80-90 y del 90-100%, respectivamente. Métodos ultrasensibles ya muestran una sensibilidad y una especificidad del 95,3 y el 98%, respectivamente Rossi M, Candelise N, Baiardi S, Capellari S, Giannini G, Orrù CD, et al. Ultrasensitive RT-QuIC assay with high sensitivity and specificity for Lewy body-associated synucleinopathies. Acta Neuropathol. 2020 Jul;140(1):49-62. Erratum in: Acta Neuropathol. 2020 Aug;140(2):245. [Pubmed][40]      .
• RT-QuIC en piel: sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 96 y el 96%, respectivamente Manne S, Kondru N, Jin H, Serrano GE, Anantharam V, Kanthasamy A, et al. Blinded RT-QuIC Analysis of α-Synuclein Biomarker in Skin Tissue From Parkinson's Disease Patients. Mov Disord. 2020 Dec;35(12):2230-9. [Pubmed][41]      .
• RT-QuIC en saliva: sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 76 y el 94,4%, respectivamente Luan M, Sun Y, Chen J, Jiang Y, Li F, Wei L, et al. Diagnostic Value of Salivary Real-Time Quaking-Induced Conversion in Parkinson's Disease and Multiple System Atrophy. Mov Disord. 2022 May;37(5):1059-63. [Pubmed][42]      .
• RT-QuIC en glándula submaxilar: la sensibilidad y la especificidad para diferenciar EP y cuerpos de Lewy incidentales de controles fue del 100 y el 94%, respectivamente Manne S, Kondru N, Jin H, Anantharam V, Huang X, Kanthasamy A, Kanthasamy AG. α-Synuclein real-time quaking-induced conversion in the submandibular glands of Parkinson's disease patients. Mov Disord. 2020 Feb;35(2):268-78. [Pubmed][43]      .
• RT-QuIC en mucosa olfatoria: sensibilidad y especificidad para diferenciar EP vs. controles del 56-80 y el 89,8%, respectivamente Stefani A, Iranzo A, Holzknecht E, Perra D, Bongianni M, Gaig C, et al.; SINBAR (Sleep Innsbruck Barcelona) group. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 2021 May 7;144(4):1118-26. [Pubmed][36]      . En combinación con RT-QuIC de LCR, especificidad cercana al 100% Bongianni M, Catalán M, Perra D, Fontana E, Janes F, Bertolotti C, et al. Olfactory swab sampling optimization for α-synuclein aggregate detection in patients with Parkinson's disease. Transl Neurodegener. 2022 Jul 28;11(1):37. Erratum in: Transl Neurodegener. 2022 Aug 12;11(1):38. [Pubmed][44]      .
• RT-QuIC en plasma: no se puede realizar. De hecho, la presencia accidental de sangre en el LCR podría interferir en la determinación.

Tabla 1.